细胞逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性荧光定量检测试剂盒 产品说明书（中文版）

细胞逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过双链分子底物，在dTTP的参与下，通过逆转录酶的催化，聚合产生RNA-DNA异源双链DNA分子，由PicoGreen特异染色，即采用荧光法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）逆转录酶的活性，以及抑制剂检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent F）避免光照；有效6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30，充分混匀

11． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

12． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）

13． 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管

14． 即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g

15． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

16． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

17． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长490nm，散发波长520nm；增益倍数50至100 

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 分别加入10微升裂解液（Reagent B）到1至5号管

5． 移取10微升标准液（Reagent H）到1号管，混匀

6． 小心移取10微升1号管稀释的标准液（Reagent H）到2号管，混匀

7． 小心移取10微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀

8． 小心移取10微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀

9． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

四、样品测定

测定开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升离心管，加入900微升稀释液（Reagent G），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：5次操作量；根据需要调整），放在暗室里备用。然后进行下列操作

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：失活样品和待测样品

2． 分别移取15微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的对应孔里

3． 分别加入5微升底物液（Reagent D）

4． 分别加入5微升失活样品或待测样品（注意：50微克裂解悬液蛋白）

5． 室温下孵育60分钟

6． 分别加入2微升终止液（Reagent E）

7． 分别加入173微升染色工作液

8． 室温下孵育5分钟，避免光照

9． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

10． 实际荧光读数：待测样品相对荧光读数－失活样品相对荧光读数

11． 根据标准曲线获得样品对应DNA浓度（纳克/毫升）

12． 实际活性计算：

[根据标准曲线获得样品对应DNA浓度（纳克/毫升）X 0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[ 0.005（样品容量；毫升）X 1（小时；反应时间）]＝纳克DNA/小时/毫升 

转换：纳克DNA/小时/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳克DNA/小时/毫克

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 每个样品需要进行平行测试：失活样品和待测样品，以排除样品DNA本底

6． 失活样品：将待测样品置于70至90度水浴锅孵育10分钟，然后置于冰槽里冷却

7． 样品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等

8． 反应完成后即刻进行荧光测定

9． 测定值由低到高变化

10． 样本测定样品读数高于背景读数表明具有酶活性

11． 待测样本为粗提酶样品，其蛋白浓度为10微克/5微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13． 逆转录酶单位活性定义为：在25℃，pH 8.1条件下，每小时内能够转录1纳克DNA所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列逆转录酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司