| 主要用途 细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。 产品内容 清理液（Reagent A） 60毫升 染色液（Reagent B） 200微升 稀释液（Reagent C） 20毫升 保存液（Reagent D） 10毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效期6月 用户自备 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离 细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基 15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器 1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器 培养箱：用于反应孵育 血细胞计数仪：用于细胞计数 台式离心机：用于样品操作 比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器 细胞流式仪：用于细胞荧光分析 （共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析 实验步骤 一、 间接法 实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入990微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。 1． 准备1瓶25cm2细胞培养瓶的待测细胞 2． 小心抽去细胞培养液 3． 加入3毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面 4． 小心抽去清理液（Reagent A） 5． 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面 6． 置入37℃培养箱1分种 7． 振动培养瓶，使细胞脱落 8． 加入4毫升用户自备的细胞培养液 9． 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始） 10． 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数 11． 移出1 X 106细胞到新的15毫升锥形离心管 12． 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g 13． 小心抽去上清液 14． 加入1毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀 15． 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照 16． 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g 17． 小心抽去上清液 18． 加入预冷的400微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群 19． 放进冰槽里 20． 选择下列方式进行操作： a) 即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上―― 波峰右移，表明超氧阴离子含量高 b) 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）： 1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片 2）激发波长540nm，散发波长590nm―― 红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高 c) 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）： 1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿 2）加入600微升保存液（Reagent D） 3）上下倾倒混匀数次 4）放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长590nm―― RFU增高，表明超氧阴离子含量高 二、 直接法 实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入990微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。 1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％ （注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项5） 2．小心抽去细胞培养液 3．小心沿着孔壁加入500微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的 染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面 4．放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟 5．小心抽去含有染色工作液 6．小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的保存液（Reagent D）到细胞培养孔 7．选择下列方式进行操作： （A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）： 激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高 （B） 使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）： 放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长540nm，散发波长590nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定荧光清晰 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
