分光光度法 50 管/24 样
注意：正式测定之选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义：TPX 属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与GPX 类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶。TPX 普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX 与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX 的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。 测定原理：TPX 催化 H2O2 氧化二硫苏糖醇（DTT），H2O2 的吸收波长为 240nm，通过测定 240nm 吸光度的下降速率，通过对照减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的 H2O2，即可计算出 TPX 活性。因此，本试剂盒可以同时测定样品 TPX 和 CAT 活性。 自备仪器和用品:紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水试剂组成和配制: 试剂一：液体×1 瓶，室温保存。 试剂二：液体×1 瓶，- 20℃保存。 试剂三：液体×1 瓶，4℃。 粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TPX 测定操作：1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 240 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一和试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴预热 30 min。 3. CAT 活性测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 20 μ L 上清液，900 μ L 试剂一，80 μ L 试剂三，迅速混匀后于 240 nm 测定 10 s 和 130 s 吸光度，记为A1 和A2。 4. 总活性测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 20 μ L 上清液，900 μ L 试剂二，80 μ L 试剂三， 迅速混匀后于 240 nm 测定 10 s 和 130 s 吸光度，记为A3 和A4。 注意：每个样品都需要做对照管，以减去过氧化氢酶（CAT）催化降解的 H2O2。TPX 活性计算公式：(1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。 CAT 活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =573×(A 1－A2)÷Cpr 总活性（nmol/min /mg prot）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T
=573×(A 3－A4)÷Cpr TPX 活性（nmol/min /mg prot）=总活性－CAT 活性 (1). 按样本质量计算 活性单位定义：25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。 CAT 活性（nmol/min/g）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T =573×(A 1－A2)÷W 总活性（nmol/min/g）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T =573×(A 3－A4)÷W TPX 活性（nmol/min /g）=总活性－CAT 活性 （3） 按细胞数量计算 活性单位定义：25℃或者 37℃中，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。 CAT 活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T =573×(A 1－A2)÷细胞数量 总活性（nmol/min/104 cell）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 573×(A 3－A4)÷细胞数量 TPX 活性（nmol/min/104 cell）=总活性－CAT 活性 （4） 按液体体积计算 活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol H2O2 降解为 1 个酶活单位。 CAT 活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T =573×(A 1－A2) 总活性（nmol/min /mL）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T =573×(A 3－A4) TPX 活性（nmol/min /mL）= 总活性－CAT 活性 ε：H2O2 的摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000 μ L=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20 μ L=0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间（min），2min。
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