主要用途
组织多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚，受到PARP-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体等）多聚ADP核糖聚合酶-1的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
保存方式 保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 （微型）台式离心机：用于样品制备 比色皿或96孔板：用于比色的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。 一、 样品准备（总蛋白制备） 1． 手术取出动物组织，并秤重以确定200至500毫克组织重量 2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管 3． （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次 4． 移入到一个液氮冻存管 5． 即刻放进液氮罐过夜 6． 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融） 7． 放进一个15毫升锥形离心管 8． 加入预冷的200至500微升裂解液（Reagent B） 9． 转移到预冷的1.5毫升离心管 10． 强力涡旋震荡30，充分混匀 11． 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用） 12． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 13． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、 测定准备 1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零 2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；缓冲液（Reagent C）室温下预热 三、 背景对照测定 1． 移取195微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入25微升反应液（Reagent D） 3． 加入25微升底物液（Reagent E） 4． 加入5微升阴性液（Reagent F） 5． 上下倾倒数次，混匀 6． 在37℃温度下孵育1小时 7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数 一、 样品测定 1． 移取195微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入25微升反应液（Reagent D） 3． 加入25微升底物液（Reagent E） 4． 加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克组织裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈） 5． 上下倾倒数次，混匀 6． 在37℃温度下孵育1小时 7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 五、计算样品活性 [（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.005（样品容量；毫升）X 18.5（毫摩尔吸光系数）X 1（反应时间；小时）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克 单位＝微摩尔对硝基苯酚/小时
注意事项 1． 本产品为20次操作，包括背景对照 2． 操作时，须戴手套 3． 系统操作过程中，背景测定只需1次 4． 样品须澄清，至关重要 5． 用户可以选择使用核蛋白替代产品中的总蛋白制备 6． 测定值由低到高变化；反应可持续1小时 7． 比色测定后，比色皿须清洗彻 8． 样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性 9． 建议待测样本蛋白浓度：核蛋白为20微克/5微升；总蛋白为100微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 11． 多聚ADP核糖聚合酶-1单位活性定义为：在37℃，pH 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位 12． 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
