双抗体夹心法检测HBsAg过程及方法
临床输血中如果输入含肝炎标志物的血液,有40%-76%受血者将患有肝炎危险.以下我们将介绍用青岛捷世康生物科技有限公司销售的elisa试剂盒以双抗体夹心法检测乙型肝炎的操作方法以及常见问题的解决方法.
实验原理
ELISA双抗体夹心法的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体,然后和待检徐庆忠的相应抗原结合形成免疫复合物,洗涤后在加酶标抗体,与免疫复合物中的抗原结合性成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物,加底物显色,判断抗原含量,一下我们将以HBsAg为例为您展示我公司生产的ELISA试剂盒的操作.
试剂与器材:
人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA试剂盒(青岛捷世康生物科技有限公司)
温箱
酶标反应板
酶标分光光度计.
操作方法:
1 包被 取包被液适当稀释的HBsAg-IgG 0.1ml,加到聚苯乙烯反应板各孔中,*后一孔不加以作为空白对照.加盖,4度24小时.次日用洗涤液充分洗涤3次,甩干.
2 隔空内加稀释倍数的待检血清0.1ml,同时加阳性和阴性对照血清,置于43度温箱60min,移去液体.同前法洗涤三次,甩干.
3各孔内加入稀释HRP-抗 HBs-IgG 0.1ml,置于43度温箱60min,移去液体,洗涤三次,甩干.
4 各孔加底物液0.1ml 置于黑暗处20min
5 各孔加入2mol/L H2SO4 0.05ml,终止反应.
结果
1目测法 阳性孔呈橘黄色,阴性孔无色或及浅黄色.
2 比色法 用酶标分光光度计测 计算P/N值.如P/N≥2.1,结果为阳性,负责为阴性.
双抗体夹心法试验简便,敏感,特异,但试验中需要注意以下问题
1 双抗体夹心法测定中应注意RF的干扰.RF是一种自身抗体,具有和多种动物IgG的Fc端结合的能力.测定时可同时结合固相抗体和酶标抗体,也能催化底物显色,出现假阳性反应.反应中的抗体试剂若先经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理,去除Fc段可有效改善特异性.
2标本应无溶血,因红细胞溶解会释放出过氧化物酶活性的底物,再以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本有可能导致特异显色:标本以新鲜采集为宜,污染细菌的标本坑能产生非特异显色,印军体重可能含有内源性HRP.
3 保存过程采用恒温水浴箱,用塑料黏纸密封反应板孔,让反应板飘浮在水面上,如用温箱应放在湿盒中,不能数块ELISA板叠放.
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