主要用途
细菌氢ATP酶（H＋-ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在排除其它ATP酶干扰的情况下，受到氢ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞H＋-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
保存方式 保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效期 6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器 （微型）台式离心机：用于样品操作 恒温摇床：用于细菌培养 培养箱：用于反应孵育 比色皿：用于光谱分析的容器 分光光度仪：用于光谱分析 实验步骤 实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。 一、 样品准备 1． 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM 2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升 3． 置于冰槽里5分钟 4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g 5． 小心抽去上清液 6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀 7． 转移到预冷的1.5毫升离心管 8． 强力涡旋震荡15 9． 置于冰槽里30分钟，期间强力涡旋震荡15三次 10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415） 11． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 12． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 13． 小心去掉上清液 14． 加入xx微升保存液（Reagent B），混匀 15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、测定准备 1． 准备好待测样品（例如纯化细菌细胞膜蛋白等），置于冰槽里 2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零 3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度 三、 样品活性测定 1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 3． 加入xx微升反应液（Reagent E） 4． 加入xx微升底物液（Reagent F） 5． 放进37℃培养箱里静置3分钟 6． 加入50微升待测样品（注意：50微克膜蛋白；样品须溶解） 7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3之内） 8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟 四、 计算样品活性 注意事项 1． 本产品为21次操作，包括背景对照测定 2． 操作时，须戴手套 3． 系统操作过程中，背景测定只需1次 4． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等 5． 加入样品启动反应后3内即刻光谱测定 6． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟 7． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性 8． 光谱测定后，比色皿须清洗充分 9． 建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1） 10． 样品特异活性是指排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性 11． 氢ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位 12． 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定检测准确 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
