| 主要用途 体液黄嘌呤氧化酶活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过黄嘌呤氧化酶和过氧化酶酶偶联反应系统中生成的过氧化氢，与非荧光性染料乙酰二氢氧吩恶嗪反应产生高度荧光的羟基异吩恶唑酮后荧光峰值的变化，来测定体液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体体液样品（血液、精液、脑脊液、尿液等）黄嘌呤氧化酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
用户自备 抗凝管：用于血液采集的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器 4℃（微型）台式离心机：用于样品处理 培养箱：用于反应孵育 比色皿或96孔板：用于荧光分析的容器 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析 实验步骤 一、 样品准备 选择一：血浆样品 1． 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管） 2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里 3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 4． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层） 5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存 选择二：血清样品 1． 准备好不含抗凝剂的储存管 2． 抽取1毫升血液，置于储存管里 3． 室温下，静置30分钟，直至血液凝结 4． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415） 5． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层） 6． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 7． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存 选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品 1． 准备好1.5毫升离心管 2． 移取1毫升液体到离心管 3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 4． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存 二、 测定准备 1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里 2． 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长530nm，散发波长590nm，并置零 3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 4． 加入180微升缓冲液（Reagent A）到1号管 5． 分别加入100微升缓冲液（Reagent A）到2至5号管 6． 移取20微升标准液（Reagent D）到1号管，混匀 7． 小心移取100微升1号管稀释的标准液（Reagent D）到2号管，混匀 8． 小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent D）到3号管，混匀 9． 小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent D）到4号管，混匀
二、 样品测定 1． 移取140微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入50微升待测样品（注意：50微克蛋白总量） 3． 加入10微升反应液（Reagent B） 4． 加入50微升底物液（Reagent C） 5． 上下倾倒数次，混匀 6． 在37℃温度下孵育30分钟 7． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数 8． 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升） 三、 计算样品活性 [根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）] ÷0.05（待测样品容量；毫升）X 30（反应时间；分钟）＝皮摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟 四、 酶标仪测定 1． 在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品 2． 分别移取140微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里 3． 分别加入50微升待测样品（50微克蛋白总量）或上述制备的标准液（Reagent D） 4． 分别加入10微升反应液（Reagent B） 5． 分别加入50微升底物液（Reagent C） 6． 轻轻摇动96孔板 7． 在37℃温度下孵育30分钟 8． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数 9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升） 10． 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升） 11． 活性计算： [根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）] ÷0.05（待测样品容量；毫升）X 30（反应时间；分钟）＝皮摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟 注意事项 1． 本产品为20次操作，包括标准样品 2． 操作时，须戴手套 3． 建议样品保存在－70℃冰箱里 4． 系统操作过程中，标准样品测定只需1次 5． 测定值由低到高变化；测定可以持续30分钟 6． 荧光测定后，比色皿须清洗充分 7． 样本测定30分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性 8． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1） 9． 如果用户没有匹配的荧光滤波器，可以使用530至570nm激发波长和590至600nm散发波长的任一波长替代 10． 如果用户没有荧光分光仪，可以使用分光光度仪替代，波长为570nm 11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 12． 黄嘌呤氧化酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每小时内能够氧化产生1微摩尔羟基异吩恶唑酮所需的酶量作为一个活性单位 13． 本公司提供系列氧化酶检测试剂产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定
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