主要用途
组织ROS激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物,在ROS敏感性抑制剂存在的情况下,受到ROS磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析组织裂解样品中ROS活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或纯化酶样品中ROS激酶的活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。
产品内容 清理液(Reagent A) 毫升 裂解液(Reagent B) 毫升 缓冲液(Reagent C) 毫升 酶促液(Reagent D) 微升 反应液(Reagent E) 微升 底物液(Reagent F) 微升 阴性液(Reagent G) 微升 性液(Reagent H) 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效6月 用户自备 ROS激酶:用于抑制剂筛选 1.5毫升离心管:用于样品保存的容器 15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器 (微型)台式离心机:用于细胞预处理 100微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器 分光光度仪或酶标仪:用于样品光度分析 实验步骤 一、 待测样品准备 1. 手术取出动物组织,并秤重500毫克组织重量 2. (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管 3. (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗 4. (选择步骤)抽去清理液 5. 移入到一个液氮冻存管 6. 即刻放进液氮罐过夜 7. 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融) 8. 放进一个15毫升锥形离心管 9. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B) 10. 强力涡旋震荡30,充分混匀 11. 放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用) 12. 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g 13. 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管 14. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1) 15. 放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用 二、 测定准备 1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里 2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零 3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
一、 背景对照测定 1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入xx微升酶促液(Reagent D) 3. 加入xx微升反应液(Reagent E) 4. 加入xx微升底物液(Reagent F) 5. 放进30℃培养箱里静置3分钟 6. 加入xx微升阴性液(Reagent G) 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟 二、 样品总活性测定 1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入xx微升酶促液(Reagent D) 3. 加入xx微升反应液(Reagent E) 4. 加入xx微升底物液(Reagent F) 5. 放进30℃培养箱里静置3分钟 6. 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解) 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟 三、 样品非特异活性测定 检测开始,移取xx微升缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。 1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入xx微升酶促液(Reagent D) 3. 加入xx微升反应液(Reagent E) 4. 加入xx微升底物液(Reagent F) 5. 放进30℃培养箱里静置3分钟 6. 加入20微升上述预处理的待测样品 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟 注意事项 1. 本产品为20次操作,包括背景操作 2. 操作时,须戴手套 3. 系统操作过程中,背景测定只需1次 4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 5. 样品须澄清,至关重要 6. 加入样品启动反应后3内即刻光度测定 7. 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟 8. 光度测定后,比色皿须清洗 9. 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性 10. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1) 11. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度 12. 可以使用ROS抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照 13. ROS激酶活性单位浓度定义:在30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位 14. 本公司提供系列受体型酪氨酸蛋白激酶检测试剂产品 质量标准 1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定检测敏感 原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司 |