| 1 原理及用途 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测奶粉、牛奶、组织、饲料、蛋类、血清等样本中的三聚氰胺（Melamine，MEL），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样本溶液，样本中的三聚氰胺和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含三聚氰胺含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三聚氰胺的残留量。 2 技术指标 2.1 试剂盒灵敏度：2ppb(ng/ml) 2.2 反应模式：25℃，30min～15min 2.3 检测下限： 奶粉……………………………………40ppb 牛奶……………………………………54ppb 牛奶/奶粉（处理法二）………………2ppb 组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）………4ppb 饲料……………………………………200ppb 蛋类……………………………………40ppb 血清……………………………………8ppb 2.4 交叉反应率： 三聚氰胺………………………………100% 三聚氰酸………………………………60% 三嗪、三嗪二铵………………………<1% 2.5 样本回收率： 牛奶、奶粉………………………90%±20% 组织………………………………85%±20% 饲料………………………………85%±20% 蛋类………………………………80%±20% 3 试剂盒组成 酶标板……………………………96孔 标准液：各1ml 0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb 高标准液（红盖）：1ppm…………1ml 酶标记物（红盖）…………………5.5ml 抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml 底物液A（白盖）……………………6ml 底物液B（黑盖）……………………6ml 终止液（黄盖）………………………6ml 20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml 2×复溶液（黄盖）…………………50ml 说明书 ………………………………1份 盖板膜…………………………………1张 自封袋…………………………………1个 4 需要的器材和试剂 4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g） 4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl 4.3 试剂：乙腈、氢氧化钠、浓盐酸、正己烷、甲醇 5 样本处理 5.1 样本处理须知： 实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。 5.2 配液： 配液1：1M HCl 溶液 取8.6ml浓HCl加去离子水混匀，定容至100ml。 配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液 84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均匀。 配液3：0.1M NaOH 溶液 称取0.4g NaOH加去离子水混匀溶解，定容至100ml。 配液4：1M NaOH 溶液 称取4g NaOH加去离子水至100ml。 配液5：复溶液 将2×复溶液用去离子水2倍稀释(1份2×复溶液加1份去离子水)，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。 配液6:工作洗涤液 将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。 5.3 样本处理步骤： 5.3.1 牛奶用样本处理方法： 1）取牛奶样本600µl到2ml的离心管中，加入1ml乙腈，充分振荡混匀；4000r/min离心5min； 2）取100µl上清液，加入900µl复溶液，混匀； 3）取50 µl用于分析。 牛奶样本稀释倍数：27 检测下限：54ppb 5.3.2 奶粉用样本处理方法： 1）称取2.0±0.05g奶粉样本至50ml离心管中，加入4ml甲醇，充分振荡； 2）4000r/min离心10min，取100µl上清液，再加入900µl复溶液，混匀； 3）取50µl用于分析。 奶粉样本稀释倍数：20 检测下限：40ppb 5.3.3 牛奶/奶粉样本处理方法二： 1）取2ml奶样或2g奶粉至离心管中； 2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，4000r/min离心10min，取4ml上清液50-60℃下氮气或空气流吹至完干燥； 3）用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml复溶液，混合30s，离心去除上层正己烷相； 4）取下层水相50µl用于分析。 样本稀释倍数：1 检测下限：2ppb 5.3.4 组织（鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏）样本处理方法： 1）取2.0±0.05g均匀组织样本于50ml离心管中； 2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，4000r/min离心10min，取2ml上清液50-60℃下氮气或空气流吹至完干燥； 3）用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml复溶液，混合30s，离心去除上层正己烷相； 4）取下层水相50µl用于分析。 样本稀释倍数：2 检测下限：4ppb 5.3.5 饲料样本处理方法： 1）将饲料样品研碎，称2.0±0.05g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去离子水均质； 2）旋流1min，放振荡器上振荡2min； 3）4000r/min离心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH将pH值调至6-8。（注：因饲料样品的不同，加入1M NaOH的量有所差异，根据情况调节，一般加入范围是0.5ml—1ml之间） 4）4000r/min 离心15min，吸出上清液（如果上清仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）； 5）取上清液用复溶液10倍稀释（取100µl上清液加入900µl复溶液，混合均匀）； 6）取50µl进行分析。 样本稀释倍数：100 检测下限：200ppb 5.3.6 蛋类样本处理方法： 1）用均质器低速均匀样本（蛋清、蛋黄或全蛋）； 2）称取2.0±0.05g均质过的样本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液后会形成一团胶状物，较蛋黄或全蛋难摇匀，此情况为正常现象不影响实验结果） 3）4000r/min离心10min，取1ml上清液50-60℃下氮气或空气流吹至完干燥； 4）用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml复溶液，混合30s，离心去除上层正己烷相； 5）取下层水相用复溶液4倍稀释（50µl样本液加150µl复溶液），混合30s； 6）取50µl用于分析。 样本稀释倍数：20 检测下限：40ppb 5.3.7 血清样本处理方法： 1）取0.5ml血清样本于50ml离心管中； 2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振荡2min，4000r/min离心10min，取1ml上清液50-60℃下氮气或空气流吹至完干燥； 3）用1ml正己烷溶解干燥的残留物后，再加入1ml复溶液，混合30s，离心去除上层正己烷相； 4）取下层水相50µl用于分析。 样本稀释倍数：4 检测下限：8ppb 6 酶联免疫试验步骤 将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。 6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5混匀，25℃反应30分钟。 6.3 洗 涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30后弃去，重复洗涤5次，后一次拍干。（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 6.4 显 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。 6.5 终 止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。 6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
