| 测定意义： AsA 作为植物细胞一个重要生理指标，其 AsA 的含量、氧化还原状态(AsA/DHA 比率)及其合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫的响应。DHA 是 AsA 的可逆的氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。 测定原理： DTT 还原 DHA 生成 AsA，通过测定体系中 AsA 的生成速率，即可计算出 DHA 含量。 自备仪器和用品： 低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体 50 mL×1 瓶，室温保存。 试剂二：液体 40 mL×1 瓶，室温保存。 试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用加入 10mL 蒸馏水充分溶解。 标准品：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用加入 5.743 mL 蒸馏水充分溶解；吸取 0.1 mL 上述溶液，加入 0.9 mL 蒸馏水，混匀，即为 100μmol/L DHA。 样品中 DHA 提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10 4 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7 ， 总时间 3min）；12000g，4℃离心 10min，取上清液置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 DHA 测定操作： 1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。 3. 标准管：依次在 1mL 石英比色皿加入100μL标准液、800μL预热的试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2，△A空白管=A2-A1。 4. 测定管：依次在1mL石英比色皿加入100μL上清液、800μL预热的试剂二和 100μL试剂三，迅速混匀后于265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A3 和 A4，△A 测定管=A4-A3。 注意：标准管只需测定一次。 计算公式： (1) 按蛋白浓度计算 DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样） =100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr (2) 按样本质量计算 DHA(nmol/g) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷W (3) 按细胞数量计算 DHA(nmol/104 cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V标准]÷(W×V样÷V样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量 （4）按液体体积计算 DHA(nmol/mL) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样 =100×△A 测定管÷△A 标准管 C 标准液：100μmol/L；V 标准：标准液体积，0.1mL；V 样总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；W：样品质量，g。 注意事项： 1. 临用配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。 2. 检出限为 10μmol/L。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
