| 产品简介： 外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等，2×HEPES缓冲盐溶液主要用于磷酸钙转染，其主要成分为HEPES，HEPES是一种非离子两性缓冲剂，能有效控制pH值在6.8～8.2范围，尤其在pH7.2 ～ 7.4具有较好的缓冲能力， 终浓度一般为10 ～ 50mmol/L ， 培养液内含20mmol/LHEPES 即可达到较好的缓冲能力。 HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS)是一种常用的细胞转染溶液，主要由HEPES、氯化钠、磷酸盐等组成，其适pH值为7.05～7.12，经过滤除菌处理；影响磷酸钙转染效率的因素主要有沉淀中 DNA 含量、DNA 在细胞上停留的时间、休克时间； 2×HeBS要求DNA 浓度在10～50μg为宜，Hela、BALB 等细胞沉淀放置 16h，CHO、DUKX、 BⅡ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。该试剂仅用于科研域， 不适用于临床诊断或其他用途。
自备材料： 1、胰蛋白酶消化液 2、PBS 3、无菌水 4、CaCl2 溶液 5、甘油或DMSO 6、筛选药物 操作步骤(仅供参考)： 1、在转染24h用蛋白酶消化培养细胞，取适量数期细胞转移至新的培养器皿中，使细胞在转染时生长状态良好。 2、在加入DNA 之2～4h，按9ml/10cm 培养皿的比例加入充分培养液，置于37℃
5%CO2 培养箱培养。 3、取适量乙醇沉淀的DNA 溶解于450ul 无菌水中，加入50ul 2.5MCaCl2，并充分混匀， 使Ca2+终浓度达到0.25M。 4、用移液器一边吹打 2×HeBS，一边逐滴加入配制好的 DNA/CaCl2 溶液(操作应迅速，一般在 30～60s)，并剧烈振荡 5s，室温下静置20～30min 以形成沉淀。 5、取沉淀均匀加入到培养皿细胞中，轻轻晃动使沉淀于培养液充分混匀，置于37℃5% CO2培养箱培养4～16h；如果培养细胞为CHO、DUKX等，可以DMSO或甘油进行休克处理，转染效率会大大增加，即培养4～6h后用2ml 含10%甘油或20%DMSO的充分培养液替换当培养液，室温下静置3min，加5ml PBS 摇动混匀。 6、去除培养液，用 PBS 清洗细胞2次，加入5～10ml 充分培养液继续培养。 7、对于瞬时转染，在转染的不同时间点内收集细胞并检测，一般时间多控制在12～60h 以内。 8、对于稳定转染，转染后在非选择性培养液培养18～48h，一般时间多控制在24～36h， 以便外源基因表达。 9、用胰蛋白酶消化细胞并传代，更换适当的选择培养液继续培养，没2～4d 更换一次选择培养液，一般10～14d 会出现目的细胞克隆。 注意事项： 1、 注意无菌操作，尽量避免污染。 2、 对于瞬时转染，可以不用乙醇沉淀的DNA。 3、 休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。 4、 转染12～24h 后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。 5、 该试剂用于转染时应检测其转染效率，好的转染效率应介于30～60%之间。 6、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效；4℃可储存6个月。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
