微量法正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶， 既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。 测定原理： 在Rubisco 的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA），PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。 需自备的仪器和用品： 分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：25mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用加入700uL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃ 保存一周； 试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用加入700uL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃ 保存一周； 粗酶液制备 ： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、 样本测定 （1） 工作液的配制：临用在试剂二中加入22.5mL试剂一，充分混匀，在37℃（哺乳动物） 或 25℃（其它物种）孵育 5min；现配现用； （2） 在微量石英比色皿或96孔板中加入6uL样本、7uL试剂三、7uL试剂四和180uL工作液，混匀，立即记录340nm处20s时吸光值A1和2min20s时的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。 Rubisco活性计算： a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算 单位的定义：25℃中1mg蛋白1min氧化1nmol NADH。 Rubisco 活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T =2680×ΔA÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。2、按样本鲜重计算 单位的定义：25℃中1g组织1min氧化1nmol NADH。 Rubisco 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T=2680×ΔA÷W 上述计算公式中各符合含义： V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.006 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g； b. 使用96孔板测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算 单位的定义：25℃中1mg蛋白1min氧化1nmol NADH。 Rubisco 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =5360×ΔA ÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。2、按样本鲜重计算 单位的定义：25℃中1g组织1min氧化1nmol NADH。 Rubisco 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T=5360×ΔA÷W 上述计算公式中各符合含义： V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.006mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g； 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
