主要用途
活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）红色荧光（TMRM）检测试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明甲酯染料，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，一旦释放到细胞浆，其荧光性显著降低，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞线粒体（动物、人体、昆虫等）膜通道孔活性（开放状态）的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。
保存方式 保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效期：6月 用户自备 24孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器 1.5毫升离心管：用于染色工作液配制和细胞染色的容器 微型台式离心机：用于沉淀细胞 培养箱：用于染色孵育 （共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析 细胞流式仪：用于细胞荧光分析 实验步骤 实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入990微升稀释液（Reagent C），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。 一、 贴壁细胞染色 1． 准备1个细胞培养24孔板的预处理后待测细胞（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项8） 2． 小心抽去细胞培养液 3． 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面 4． 小心抽去清理液 5． 小心沿着孔壁加入500微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面 6． 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟，避免光照 7． 小心抽去染色工作液 8． 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔 9． 小心抽去清理液 10． 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔 11． 选择下列方式进行操作： （A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）： 激发波长540nm，散发波长580nm――红色荧光减弱，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强 （B） 使用荧光酶标仪检测（定量检测）： 放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长580nm――RFU降低，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强 二、 悬浮细胞或脱离细胞染色 1． 将预处理后悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106细胞）移入到1.5毫升离心管 2． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 3． 小心抽去上清液 4． 加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 5． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 6． 小心抽去上清液 7． 加入500微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，充分混匀 8． 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟，避免光照 9． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 10． 小心抽去上清液 11． 加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 12． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 13． 小心抽去上清液 14． 加入500微升37℃预热的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群 15． 选择下列方式进行操作： a) 进行细胞流式仪分析：激发波长488nm氩离子激光，散发波长570nm（FL2），观察10000个细胞以上―― 波峰左移，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强 b) 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）： 1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片 2）激发波长540nm，散发波长580nm―― 红色荧光减弱，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强 c) 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）： 1）移取500微升上述细胞悬液到1毫升比色杯 2）加入500微升清理液（Reagent A） 3）上下倾倒混匀数次 4）放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长580nm―― RFU降低，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强 注意事项 1． 本产品为20次（0.5毫升体系/次）操作 2． 操作时，须戴手套 3． 操作时，避免污染母液 4． 染色，所有试剂溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃预热 5． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析 6． 孵育时，必须避免光照 7． 本产品友好使用于双重染色或重叠染色 8． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液： 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
