分光光度法 50 管/48 样正式测定取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是主要的 H2O2 清除酶， 在活性氧清除系统中具有重要作用。 测定原理：H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解 H2O2，使反应溶液 240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。 需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水 试剂组成和配制：提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 工作液：60mL×1 瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤：1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 240nm 处，蒸馏水调零。 2、测定将 CAT 检测工作液 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min。 3、取 1mLCAT 检测工作液于 1mL 石英比色皿中，再加入 35μL 样本，混匀 5s；室温下立即测定 240nm 下的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2 CAT 活性计算： 1、血清（浆）CAT 活力的计算: 单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。 CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=678×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算： （1） 按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。 CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr （2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。 CAT(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=678×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。 CAT(nmol/min/104 cell)＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T =1.356×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.035×10-3 L；ε：H2O2 摩尔消光系数，4.36×104 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.035 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。 注意事项： 1、 预实验若发现酶活性过高（起始 OD 值过大），可用提取液适当稀释样品。 2、 若样品酶活低，延长反应时间（3 分钟之内），并将反应时间准确代入计算公式。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
