主要用途 细胞胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase;CBS)活性酶连续循环光度法定量检测试剂是一种旨在使用胱硫醚-β-合成酶、赖氨酸脱羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶连续循环法反应系统中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光度法测定其氧化后峰值(NADH浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物和人体细胞裂解悬液等胱硫醚-β-合成酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。 产品内容 清理液(Reagent A) 120毫升 裂解液(Reagent B) 10毫升 缓冲液(Reagent C) 5毫升 酶促液(Reagent D) 200微升 反应液(Reagent E) 500微升 底物液(Reagent F)400微升 阴性液(Reagent G) 500微升 产品说明书 1份 保存方式 保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;底物液(Reagent F),避免光照,有效证6月 用户自备 15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器 1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器 细胞刮脱棒:用于细胞脱离 (微型)台式离心机:用于样品制备 培养箱:用于反应孵育 200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析的容器 分光光度仪或酶标仪:用于光度分析 实验步骤 实验开始,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;底物液(Reagent F)注意避光;缓冲液(Reagent C)室温下预热。然后进行下列操作。 一、 样品准备 1. 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 107细胞) 2. 小心加入3毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面 3. 小心抽去清理液 4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化) 5. 加入3毫升清理液(Reagent A),混匀细胞 6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始) 7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g 8. 小心抽去上清液 9. 加入100至500微升裂解液(Reagent B),充分混匀 10. 转移到预冷的1.5毫升离心管 11. 强力涡旋震荡15
1. 置于冰槽里孵育30分钟 2. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415) 3. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 4. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1) 5. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、测定准备 1. 准备好上述待测样品,置于冰槽里 2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长为340nm,间隔2分钟,读数6次(共10分钟),并置零 3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度 三、 背景对照测定 1. 移取140微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入10微升酶促液(Reagent D) 3. 加入20微升反应液(Reagent E) 4. 加入20微升底物液(Reagent F) 5. 放进37℃培养箱里静置3分钟 6. 加入10微升阴性液(Reagent G) 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数10分钟 四、 样品活性测定 1. 移取150微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入10微升酶促液(Reagent D) 3. 加入20微升反应液(Reagent E) 4. 加入20微升底物液(Reagent F) 5. 放进37℃培养箱里静置3分钟 6. 加入10微升待测样品(注意:100微克总蛋白;样品须溶解) 7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3之内) 8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数10分钟 五、 计算样品活性 [(样品读数-背景读数)X 0.2 (体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.01(样品容量;毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 10(反应时间;分钟)]=单位/毫升 原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司 |